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技術(shù)創(chuàng)新丨諾唯贊Dimer Free技術(shù)突破NGS行業(yè)難題
發(fā)布時(shí)間：
2024-02-18
高通量測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建時(shí)，你是不是也常常碰到這種情況：文庫(kù)峰型圖中目標(biāo)文庫(kù)前面出現(xiàn)非特異性片段，呈尖刺狀，這就是二聚體，主要是由接頭或引物自連所形成。
圖1. 含二聚體的文庫(kù)示意圖
二聚體的存在會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成較為嚴(yán)重的影響，一直是行業(yè)內(nèi)亟待解決的難題。
二聚體的存在會(huì)導(dǎo)致以下問(wèn)題：
1. 操作體驗(yàn)繁瑣
在濕實(shí)驗(yàn)階段需要針對(duì)不同投入量調(diào)整接頭用量；
2. 影響數(shù)據(jù)質(zhì)量
干擾文庫(kù)真實(shí)產(chǎn)出的測(cè)定，導(dǎo)致有效下機(jī)數(shù)據(jù)量不足，數(shù)據(jù)質(zhì)量差，難以滿足后續(xù)分析需求；
3. 增加測(cè)序成本
嚴(yán)重時(shí)需加測(cè)數(shù)據(jù)量，造成時(shí)間和人力成本相應(yīng)增加。
我們深深理解面對(duì)以上問(wèn)題時(shí)的痛苦，因此，諾唯贊研發(fā)團(tuán)隊(duì)堅(jiān)持不懈地研究，尋求創(chuàng)新的突破。經(jīng)過(guò)無(wú)數(shù)次的試驗(yàn)和改進(jìn)，最終開發(fā)出了Dimer Free技術(shù)（簡(jiǎn)稱：DF技術(shù)），能夠從根本上降低二聚體殘留，提升數(shù)據(jù)質(zhì)量，并統(tǒng)一接頭用量，優(yōu)化操作體驗(yàn)。為更準(zhǔn)確和更便捷的建庫(kù)實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航。
Dimer Free技術(shù)原理介紹
DF- Dimer Sniper消除原理
經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，T4 DNA連接酶不僅可以對(duì)接頭和模板進(jìn)行連接（TA連接），同時(shí)也能夠?qū)ζ渌黄ヅ涞膲A基進(jìn)行連接（接頭之間的TT連接）。在建庫(kù)過(guò)程中形成的小片段二聚體，就是由于這種非特異性連接形成的錯(cuò)配產(chǎn)物，見下圖2。
圖2. T4 連接酶連接示意圖
針對(duì)這一堿基錯(cuò)配特征，諾唯贊研發(fā)團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了深入研究和多次試驗(yàn)，最終從原核生物中發(fā)現(xiàn)了一種能夠識(shí)別堿基錯(cuò)配的限制性內(nèi)切酶，并以此為基礎(chǔ)，通過(guò)蛋白質(zhì)功能改造平臺(tái)，運(yùn)用理性設(shè)計(jì)和定向進(jìn)化技術(shù)，進(jìn)一步提升了該內(nèi)切酶的識(shí)別特異性和切割活性，最終成功研發(fā)出一款高效的內(nèi)切酶，命名為Dimer Sniper。該內(nèi)切酶能夠特異性地對(duì)T-T錯(cuò)配堿基進(jìn)行切割，從而有效地消除接頭二聚體。
圖3. DF- Dimer Sniper消除原理
DF- Flowsizer篩選原理
除接頭二聚體之外，在文庫(kù)擴(kuò)增過(guò)程中也會(huì)形成引物二聚體，這些二聚體的長(zhǎng)度比正常文庫(kù)偏小。基于這一特點(diǎn)以及對(duì)純化過(guò)程的深入理解，諾唯贊研發(fā)團(tuán)隊(duì)開發(fā)出一款專門去除小片段的洗脫試劑，命名為Flowsizer。其原理類似于分子篩，可以根據(jù)片段大小的差異進(jìn)行篩選，如下圖4所示。在文庫(kù)的回收過(guò)程中添加，可以特異性的對(duì)接頭和引物二聚體進(jìn)行去除，大幅提升目標(biāo)文庫(kù)比例。
圖4. DF- Flowsizer篩選原理
測(cè)試數(shù)據(jù)展示
接頭二聚清除效果測(cè)試：
對(duì)含有不同比例接頭二聚體的文庫(kù)進(jìn)行測(cè)試，接頭二聚體的去除效率均高達(dá)80%以上（最高可至100%）。
圖5. 接頭二聚體去除效果圖
引物二聚清除效果測(cè)試：
在多重?cái)U(kuò)增建庫(kù)中，文庫(kù)純化階段使用DF技術(shù)可以顯著降低引物二聚體的比例（高達(dá)90%以上），實(shí)現(xiàn)有效靶標(biāo)的高效富集，提升測(cè)序的有效數(shù)據(jù)產(chǎn)出和靶標(biāo)檢出率。
圖6. 引物二聚體去除效果圖
統(tǒng)一稀釋倍數(shù)，優(yōu)化操作流程：
在以往的建庫(kù)實(shí)驗(yàn)中，針對(duì)核酸投入量的不同，需要對(duì)接頭進(jìn)行不同比例的稀釋，以減少二聚體的產(chǎn)生。現(xiàn)在，得益于DF技術(shù)的成功研發(fā)，可以真正做到“兼容”不同模板投入量，無(wú)需調(diào)整接頭稀釋比例，如圖7所示。在提升操作體驗(yàn)的同時(shí)，也意味著在低模板投入量的場(chǎng)景下，可以通過(guò)增加接頭用量來(lái)進(jìn)一步提高文庫(kù)轉(zhuǎn)化率。
圖7. 二聚體去除效果圖
諾唯贊將對(duì)多系列產(chǎn)品統(tǒng)一引入二聚體清除技術(shù)，優(yōu)化操作體驗(yàn)，全面改善測(cè)序結(jié)果，助力您的實(shí)驗(yàn)提質(zhì)增效，敬請(qǐng)期待！
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